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以后再说X
RNA/DNA原位杂交多标染色技术 多重荧光免疫组化染色技术 HALO在分子病理的应用 HALO在免疫病理的应用 石蜡组织芯片TMA技术 常规病理检测 特殊染色 免疫组化 常见组织取材切面

服务简介

HALO可实现跨组织和细胞系的核酸探针定量分析,在细胞基础上测量双色和/或银标记的DNA或RNA的ISH探针,从而能够快速的将组织中每个细胞的基因表达谱置于整体环境中,支持包括RNAscope在内的单重或双重RNA ISH分析。

单重RNA ISH分析

示例:用单重RNA ISH探针(棕色)和苏木精复染剂探测肾脏切片
阴性细胞在图像中标记为白色,而阳性细胞的RNA探针则根据它们的RNAscope分数标记为深浅不一的红色:1-3个探针点记+1分,标记为浅粉色;4-9个探针点记+2分,标记为深粉红色;10-13个探针点记+3分,标记为淡红色;大于14个探针点记+4分,标记为暗红色。


双重RNA ISH分析

示例:在肿瘤中使用红色和蓝色探针的双重RNA ISH分析
以白色覆盖标记阴性细胞,仅对红色探针呈阳性的细胞则根据RNAscope评分标记为深浅不一的红色,而仅对蓝色探针呈阳性的细胞则根据RNAscope评分标记为深浅不一的绿色(与单重探针的分析一致),同时对两种探针均呈阳性的细胞会以黄色表示红色:蓝色探针的比例。

 

双重DNA ISH分析

示例:双重DNA ISH分析
与双重RNA ISH实验一样,只含有红色探针的细胞标记为红色,只含有黑色探针的细胞标记为绿色,同时含有两种探针的细胞标记为黄色,不含探针的细胞标记为白色。

 

区域的定量分析
利用HALO可报告细胞总数、标记点的总数、标记点的总面积、每个细胞或组织每单位面积上的标记点的平均数量、每个细胞或组织每单位面积上的标记点的平均面积,以及RNAscope得分0、1+、2+、3+和4+为计算依据的细胞数量和百分比。当存在两个探针时,还可以报告探针1与探针2的比率,并且能自动生成直方图,表示每个细胞中探针的频率分布(图1)和细胞的RNAScope得分(图2)。  

   

图1 显示了以细胞为单元的探针数量分布曲线,在这个例子中,大多数细胞显示为每个细胞中有0-5个探针拷贝。 图2显示了分别归类为0、1+、2+、3+和4+的细胞数量。图中显示RNA探针表达阳性的细胞占比较少。

 

单个细胞的ISH-IHC定量分析

HALO可实现针对逐个细胞的ISH-IHC定量分析,在细胞基础上同时测量一种IHC染色和至多双色和/或银标记的DNA或RNA的ISH探针,从而能够快速的将组织中每个细胞的相应蛋白和基因表达谱置于整体环境中,支持包括RNAscope在内的单重或双重IHC-ISH分析。
下图展示了一个ISH-IHC量化的示例:

CD3免疫组化与RNA ISH探针联合进行同样的(红色)苏木精复染。图中CD3阴性的细胞标记为蓝色,CD3阳性的细胞标记为绿色。ISH探针点根据其在细胞内被识别的大小以不同深浅的红色高亮表示。免疫组化染色可在任意间隔的细胞核、细胞质和/或膜中被识别和定量。在本示例中虽然使用的是细胞质半径来识别细胞边界,但如果使用了膜免疫组化标记,则可以使用它来定义细胞边界,从而更准确的识别每个细胞的细胞间隔。

 

具体可提供的分析包括但不限于以下内容:

IHC阳性细胞总数及百分比、IHC OD平均值
特定细胞区域的IHC阳性细胞总数、百分比及IHC OD平均值
探针1和/或探针2阳性细胞的数量及百分比
每个细胞或每个细胞区域的探针1和探针2拷贝数
针对探针1和探针2的细胞得分(0,+1,+2,+3和+4)
每种探针的总H-score
IHC标记和探针1和/探针2(双阳性和三阳性细胞)的细胞总数和百分比
生成直方图,展示每种细胞探针的频率分布(图1)和RNAscope细胞评分(图2) 

 

图1 显示了以细胞为单元的探针数量分布曲线,在这个例子中,大多数细胞显示为每个细胞中有0-5个探针拷贝。图2 显示了分别归类为0、1+、2+、3+和4+的细胞数量。


单重或双重IHC-ISH分析

可针对逐个细胞测量任何数量的荧光标记的DNA/RNA ISH探针和免疫荧光(IF)蛋白生物标志物, 从而能够快速的将组织中每个细胞的相应蛋白和基因表达谱置于整体环境中, 支持包括RNAscope在内的单重或双重IHC-ISH分析。
下图是FISH-IF定量分析的一个示例,使用DAPI和一个IF标记的膜生物标记(青色)来识别感兴趣的细胞, 在这些细胞中测量RNA FISH探针(粉红色)。 表达膜生物标志物的细胞用青色标出,FISH探针点则用粉红色标出。 IF的点能在任意区域的细胞核、细胞质和/或膜中被鉴别并定量分析。

  

具体可提供的分析包括但不限于以下内容:

IF阳性细胞总数及百分比; 

特定细胞区域的IF阳性细胞总数及百分比; 

IF强度的平均值; 

特定细胞区域IF强度的平均值; 

探针阳性细胞的数量及百分比; 

每个细胞或每个细胞区域的探针拷贝数;

针对每种探针的细胞得分(0,+1,+2,+3和+4); 

每种探针的总H-score; 

根据IF和探针的阳性情况来定义细胞表型; 

可实现在细胞基础上对DNA/RNA ISH探针进行量化;  

支持包括RNAscope在内的大多数多重RNA FISH分析。

  

该图是一个球形癌细胞的双重RNAscope分析,使用核染料DAPI识别单个细胞,并在细胞边界内测量多重的红色及绿色探针(每个细胞的探针点数和每个细胞的探针面积),可实现对每个细胞或整个分析区域中每个探针的平均数量的分析。在分析标记图像中,仅对红色探针呈阳性的细胞用不同深浅的红色高亮显示,仅对绿色探针呈阳性的细胞用不同深浅的绿色高亮显示,同时对两种探针呈阳性的细胞则用黄色高亮显示。颜色底纹由探针数量和相应的RNAscope H-score决定,深色=低表达,浅色=高表达。

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